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ELISA相关问题与解答

浏览次数: 日期:2014-10-15

摘要:

1、ELISA检测所用的样本怎样进行采取和保存?

说明:大多数ELISA检测使用血清或血浆作为样本。可以根据常规方法收集血清样品。应注意避免溶血。当红细胞溶解时,释放出具有过氧化物酶活性的物质。在HRP标记的ELISA测定中,溶血样品可增加非特异性着色。血清样品应进行新鲜检测。如果存在细菌污染,细菌可能含有内源性HRP,这也可能产生假阳性反应。通常,在5天内测量的血清样品可以放置在2-8℃。样品在冰箱中储存太长时间,导致血清IgG的聚合,尤其是间接试剂的背景;在一周内测量的样品需要 - 在20°C或更低温度下储存。冷冻血清后,蛋白质部分浓缩,分布不均匀。应彻底混合,避免气泡。具有浊度或沉降的血清样品应在澄清前进行离心或过滤。反复冷冻和解冻将导致抗体滴度下降,因此如果需要将测试抗体的血清样品储存用于多次测试,则应将其少量储存。应在无菌条件下保存血清,并可加入适当的防腐剂。由于纤维蛋白原干扰,不完全抗凝的样本是假阳性,建议尽可能使用抗凝,特别是肝素抗凝剂。

2、ELISA检测时如何保证有效洗涤?

解释:洗涤是将特异性结合固相的抗原或抗体与反应温育期间吸附的非特异性组分分离,以确保ELISA测定的特异性。因此,洗涤平板是ELISA测定的极其重要的部分。

1)强烈建议使用全自动洗衣机清洗,洗手容易造成交叉污染;

2)定期对洗衣机进行维护。使用前检查是否有孔堵塞。吸气,注射和走路的操作是否正常。通常,吸吮后每孔的残留量不超过2ul,并注入液体。每孔的量超过250ul,但不能溢出,并设定一定的浸泡时间,60秒/次,至少5次。

3、ELISA实验比色中单波长和双波长的区别?

说明:

1)中档和以上微孔板读取器基本上具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长测量选择在450nm波长下的比色测量,终止后黄色液体的最大吸收,并获得每个孔。 A值,其中A值包括液体的液体颜色的吸收值(W1)和非特异性吸收值(W2),非特异性吸收值通常是指纹的值,划痕,孔和孔底部的灰尘等。值,然后W1=A-W2,我们在比色时设置空白零,即将其减去非特定吸收值。实际上,并非每个孔都具有相同的非特定吸附值,因此单波长测量存在一定程度的不确定性,即不同的空穴位置可能获得不同的吸光度值,但仅在可接受的范围内。

2)虽然波长是双色的,但是酶标仪每次在450nm的敏感波长和诸如630nm的非敏感波长下测量。测量敏感波长的吸光度作为吸光度的特定颜色和板孔上的指纹,划痕,灰尘等。吸光度之和(M1);在非敏感波长下测量,特定显色的吸光度值为零,测得的吸光度是污垢的吸光度值(M2),最后是酶标仪给出的值,它是吸光度值之间的差值在敏感波长和极端波长处的吸光度值(A=M1-M2)。因此,当测量比色时,优选使用双波长比色。

3)选择双波长比色时,无需将空白孔设为零。如果空白孔仍然调整为零色,则可能存在吸光度为负的现象。

4、ELISA检测试剂敏感度偏低的处理方法?

说明:
1)重新实验,并注意对试剂盒温度平衡,培养时间,显色时间等影响因素的控制; 2)检查质量控制产品是否反复冻融,质控产品是否有测定内差异,质控产品是否长时间在2~8℃;4)重新评估控制的可靠性; 5)由于各种因素,样本本身似乎是弱阳性,实际上是阴性样本; 6)由于样品本身含量低,很容易随实验水平波动。这部分样品的处理应格外小心,合格的使用者应进行验证性实验; 7)注意检查实验中使用的仪器和设备是否定期校准; 8)注意实验中使用的板的批号和酶标准试剂是否相同,不应混合不同批号的试剂。

5ELISA产品检测时,出现本底偏高或者“花板”现象的主要原因分析?

说明:

洗涤的原因:

1)各制造商使用的洗涤液的配方根据各试剂的条件制备。使用不合适的洗涤液往往不能达到正常洗涤效果,这主要导致背景过高甚至花板现象。该公司的洗涤系统不建议与其他公司的工具包混合使用。

2)用于配置乳液的水应为新鲜蒸馏水或去离子水。如果使用自来水,水中含有过多的Ca2 +和Mg2 +。这些离子将占据表面活性剂,影响洗涤效果,以及水中一些微生物的内源性来源。有性物质会引起干扰和过高的非特异性反应。

3)清洗板时,应确保洗衣机中的液体注入量和剩余液体量能正常使用,否则会影响洗涤效果。一般来说,液体注射量需要300-350μl/孔,但不应溢出,避免交叉污染,残留量≤2μl,洗涤至少5次。

显色系统的原因:

1)基材B液体稍微变色,导致高背景。

2)不正确使用尖端和样品罐进行清洗也会干扰基材A和B的非特异性反应。

样本自我理由:

1)使用溶血样品,当红细胞溶解后,具有过氧化物酶活性的物质将被释放,这将增加非特异性的颜色发展;血清样本陈旧,如果有细菌污染,细菌可能含有内源性HRP。会增加非特定的颜色发展。

2)使用抗凝血不完整的样本,由于纤维蛋白原干扰引起的非特异性发色,建议尽量不要抗凝,尤其是肝素抗凝样本。

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